單細胞測序技術(single cell sequencing)是指在單個細胞水平上,對基因組、轉錄組、表觀組進行高通量測序分析的一項新技術,它能夠彌補傳統高通量測序的局限性,揭示單個細胞的基因結構和基因表達狀態,反映細胞間的異質性。2013年,單細胞測序技術被《Science》將其列為年度最值得關注的六大領域榜首;2015年再次登上Science轉化醫學封面。目前,單細胞測序技術在腫瘤、發育生物學、微生物學、神經科學、以及植物學等領域發揮重要作用,正成為生命科學研究的焦點,具有廣闊的應用前景。
單細胞轉錄組測序流程--點我了解更多
1. 擁有行業認可的10X Genomics和BD Rhapsody單細胞平臺,實現真正意義上的單細胞測序;
2. 具有豐富的、針對不同樣本類型的單細胞懸液制備經驗,如:外周血、細胞系、新鮮/凍存器官組織、腫瘤組織,確保細胞活性達到測序要求;
3. 擁有成熟的單細胞測序文庫構建技術,一次性完成1000-10000個細胞的文庫構建,真正測全組織中所有細胞類型,做到對樣本中所有類型細胞的全面解析;
4. 具備完善的單細胞測序和實驗質控流程,以及豐富的單細胞測序和數據分析經驗,實現個性化、定制化數據分析服務。
樣本類型:
組織、血液、培養的細胞系、制備好的單細胞懸液
注:若客戶樣本為組織,且無能力進行組織解離來獲取單細胞懸液,烈冰將盡可能提供技術及實驗上的幫助,但因不同類型樣本的特異性,無法保證實驗方法適用于所有類型組織。
質量要求:
1. 細胞活性大于70%
2. 濃度為500-2000細胞/μl
3. 體積不小于200μl
4. 細胞培養基及緩沖液不能含Ca2+和Mg2+
5. 細胞體積小于40μm
1. 單細胞懸液制備:根據樣本特性選擇合適的單細胞懸液制備方法,注意紅細胞裂解;如若客戶樣本為已經制備好單細胞懸液,該步驟可以省略;
2. 細胞活性檢測:細胞活性需大于70%;
3. 單細胞捕獲:通過分選平臺(BD、10X、Drop-seq)對每個細胞進行捕獲;
4. 細胞/轉錄本標簽添加:對結合磁珠標簽的RNA進行逆轉錄引入CB和UMI;
5. 文庫構建:對cDNA進行隨機引物PCR擴增;
6. 上機測序:烈冰推薦Illumina Hiseq或NovaSeq測序平臺,數據量100G/樣本。
單細胞懸液的制備流程
BD Rhapsody Scanner檢測圖
注:活細胞檢測明場圖(左),綠色熒光(中),紅色熒光(右)
圖一:Drop-Seq
哈佛醫學院Steven McCarroll領導的團隊將微流控技術引入單細胞RNA-seq方法中,開發了Drop-seq技術,且該項技術于2015年發表于《Cell》雜志上(Macosko et al., 2015)。Drop-seq技術利用微流體裝置將帶有細胞條形碼的微珠和細胞一起裝入微滴。這些液滴在一個小型設備上生成,沿著一根頭發寬的槽道流動。條形碼附著到每個細胞的一些基因上,因此科學家們可以一次測序所有的基因,追蹤每個基因的來源細胞。
圖二:10X Genomics
2016年,10X Genomics公司首次推出ChromiumTM系統,全面對接Illumina測序儀,能夠自動化完成大規模單細胞研究。10X Genomics單細胞捕獲平臺起源自Drop-Seq技術,通過“雙十字”微流控系統形成一個個含有細胞和凝膠微珠(gel bead)的油包水的乳滴(GEMs),其核心技術在于凝膠微珠表面的引物序列,由標記細胞的Barcode、標記細胞內mRNA的UMI和捕獲mRNA的Poly dT組成。10X Genomics ChromiumTM系統可實現數千乃至數萬個單細胞的分析,解決常規scRNA-seq在通量或擴展性方面存在的不足。
圖三:BD Rhapsody
BD Rhapsody?單細胞分析系統的誕生基于 BD 在細胞生物學領域 40年的專業技術, 采用CytoSeq特有的蜂窩板技術進行單細胞捕獲。該技術用20W+的微孔(該數量級遠大于Input細胞數量),保證單孔中的單細胞捕獲。同時避免了傳統微流控系統中存在的概率碰撞影響捕獲效率的問題,采用微孔捕獲相對會有更好的捕獲效率,保證Input細胞的全面使用。
NovaSeq 6000測序儀
注:橫坐標為細胞數量,縱坐標為每個細胞對應的平均counts數,根據曲線的斜率判斷實際檢測的細胞數量
注:左圖為細胞中總共檢測到的基因數量,右圖為去除重復UMI后統計的基因數量
注:橫坐標表示每個細胞中UMI的數量,縱坐標表示線粒體基因的占比情況
Azizi E et al., Cell. 2018
注:上圖為乳腺癌腫瘤組織、正常組織、血液和淋巴結樣本中免疫細胞亞群鑒定;下圖為不同組織樣本中各細胞亞群的占比情況
Dick S A et al., Nature immunology. 2019
注: marker基因的Feature Plot圖(上)和Violin圖(下)
Dick S A et al., Nature immunology. 2019
注:該圖為不同細胞亞群間差異基因聚類分析圖(Heatmap)
Dick S A et al., Nature immunology. 2019
注:該圖為不同cluster之間差異基因顯著富集的Pathway條目
Manno G L et al., Nature, 2018
注:該圖為RNA velocity分析結果圖,圖中箭頭方向代表算法預測的細胞演化方向
Dick S A et al., Nature immunology. 2019
注:細胞間狀態轉換的pesudotime軌跡圖(右)和Heatmap圖(左)
Vento-Tormo R et al., Nature. 2018
注:橫坐標表示細胞類型,縱坐標表示細胞間通訊關系,圓圈大小表示顯著性差異水平,圓圈顏色越紅表示細胞間通訊關系越強
Guo X, et al. Nature Medicine, 2018
注:橫坐標表示生存期,縱坐標表示占比,不同顏色曲線代表不同分組
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