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單細胞測序技術（single cell sequencing）是指在單個細胞水平上，對基因組、轉錄組、表觀組進行高通量測序分析的一項新技術，它能夠彌補傳統高通量測序的局限性，揭示單個細胞的基因結構和基因表達狀態，反映細胞間的異質性。2013年，單細胞測序技術被《Science》將其列為年度最值得關注的六大領域榜首；2015年再次登上Science轉化醫學封面。目前，單細胞測序技術在腫瘤、發育生物學、微生物學、神經科學、以及植物學等領域發揮重要作用，正成為生命科學研究的焦點，具有廣闊的應用前景。
單細胞轉錄組測序流程--點我了解更多
1. 擁有行業認可的10X Genomics和BD Rhapsody單細胞平臺，實現真正意義上的單細胞測序；
2. 具有豐富的、針對不同樣本類型的單細胞懸液制備經驗，如：外周血、細胞系、新鮮/凍存器官組織、腫瘤組織，確保細胞活性達到測序要求；
3. 擁有成熟的單細胞測序文庫構建技術，一次性完成1000-10000個細胞的文庫構建，真正測全組織中所有細胞類型，做到對樣本中所有類型細胞的全面解析；
4. 具備完善的單細胞測序和實驗質控流程，以及豐富的單細胞測序和數據分析經驗，實現個性化、定制化數據分析服務。
樣本類型：
組織、血液、培養的細胞系、制備好的單細胞懸液
注：若客戶樣本為組織，且無能力進行組織解離來獲取單細胞懸液，烈冰將盡可能提供技術及實驗上的幫助，但因不同類型樣本的特異性，無法保證實驗方法適用于所有類型組織。
質量要求：
1. 細胞活性大于70%
2. 濃度為500-2000細胞/μl
3. 體積不小于200μl
4. 細胞培養基及緩沖液不能含Ca2+和Mg2+
5. 細胞體積小于40μm
1. 單細胞懸液制備：根據樣本特性選擇合適的單細胞懸液制備方法，注意紅細胞裂解；如若客戶樣本為已經制備好單細胞懸液，該步驟可以省略；
2. 細胞活性檢測：細胞活性需大于70%；
3. 單細胞捕獲：通過分選平臺（BD、10X、Drop-seq）對每個細胞進行捕獲；
4. 細胞/轉錄本標簽添加：對結合磁珠標簽的RNA進行逆轉錄引入CB和UMI；
5. 文庫構建：對cDNA進行隨機引物PCR擴增；
6. 上機測序：烈冰推薦Illumina Hiseq或NovaSeq測序平臺，數據量100G/樣本。
單細胞懸液的制備流程
BD Rhapsody Scanner檢測圖
注：活細胞檢測明場圖（左），綠色熒光（中），紅色熒光（右）
圖一：Drop-Seq
哈佛醫學院Steven McCarroll領導的團隊將微流控技術引入單細胞RNA-seq方法中，開發了Drop-seq技術，且該項技術于2015年發表于《Cell》雜志上（Macosko et al., 2015）。Drop-seq技術利用微流體裝置將帶有細胞條形碼的微珠和細胞一起裝入微滴。這些液滴在一個小型設備上生成，沿著一根頭發寬的槽道流動。條形碼附著到每個細胞的一些基因上，因此科學家們可以一次測序所有的基因，追蹤每個基因的來源細胞。
圖二：10X Genomics
2016年，10X Genomics公司首次推出ChromiumTM系統，全面對接Illumina測序儀，能夠自動化完成大規模單細胞研究。10X Genomics單細胞捕獲平臺起源自Drop-Seq技術，通過“雙十字”微流控系統形成一個個含有細胞和凝膠微珠（gel bead）的油包水的乳滴（GEMs），其核心技術在于凝膠微珠表面的引物序列，由標記細胞的Barcode、標記細胞內mRNA的UMI和捕獲mRNA的Poly dT組成。10X Genomics ChromiumTM系統可實現數千乃至數萬個單細胞的分析，解決常規scRNA-seq在通量或擴展性方面存在的不足。
圖三：BD Rhapsody
BD Rhapsody?單細胞分析系統的誕生基于 BD 在細胞生物學領域 40年的專業技術， 采用CytoSeq特有的蜂窩板技術進行單細胞捕獲。該技術用20W+的微孔（該數量級遠大于Input細胞數量），保證單孔中的單細胞捕獲。同時避免了傳統微流控系統中存在的概率碰撞影響捕獲效率的問題，采用微孔捕獲相對會有更好的捕獲效率，保證Input細胞的全面使用。
NovaSeq 6000測序儀
注：橫坐標為細胞數量，縱坐標為每個細胞對應的平均counts數，根據曲線的斜率判斷實際檢測的細胞數量
注：左圖為細胞中總共檢測到的基因數量，右圖為去除重復UMI后統計的基因數量
注：橫坐標表示每個細胞中UMI的數量，縱坐標表示線粒體基因的占比情況
Azizi E et al., Cell. 2018
注：上圖為乳腺癌腫瘤組織、正常組織、血液和淋巴結樣本中免疫細胞亞群鑒定；下圖為不同組織樣本中各細胞亞群的占比情況
Dick S A et al., Nature immunology. 2019
注： marker基因的Feature Plot圖（上）和Violin圖（下）
Dick S A et al., Nature immunology. 2019
注：該圖為不同細胞亞群間差異基因聚類分析圖（Heatmap）
Dick S A et al., Nature immunology. 2019
注：該圖為不同cluster之間差異基因顯著富集的Pathway條目
Manno G L et al., Nature, 2018
注：該圖為RNA velocity分析結果圖，圖中箭頭方向代表算法預測的細胞演化方向
Dick S A et al., Nature immunology. 2019
注：細胞間狀態轉換的pesudotime軌跡圖（右）和Heatmap圖（左）
Vento-Tormo R et al., Nature. 2018
注：橫坐標表示細胞類型，縱坐標表示細胞間通訊關系，圓圈大小表示顯著性差異水平，圓圈顏色越紅表示細胞間通訊關系越強
Guo X, et al. Nature Medicine, 2018
注：橫坐標表示生存期，縱坐標表示占比，不同顏色曲線代表不同分組
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